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操作流程 3

安全預(yù)防

• 當(dāng)使用 qEV 柱時(shí)采取適當(dāng)?shù)膫€(gè)人防護(hù)措施，比如實(shí)驗(yàn)服，手套和防護(hù)鏡。

• 柱子的抗菌溶液包含 0.05% w/v 的疊氮化鈉。大量的疊氮化鈉有毒，所以應(yīng)該避免皮膚和眼睛的直接接觸。

• 廢棄緩沖液應(yīng)妥善處理。疊氮化鈉會(huì)在銅制管道中累積引起爆炸。

• 生物樣品可能有危險(xiǎn)，當(dāng)使用 qEV 柱時(shí)，請(qǐng)教實(shí)驗(yàn)室安全員有關(guān)樣品安全操作的要點(diǎn)。

保存

柱子保存在含有抑菌劑（例如 20 %乙醇，或<0.05 % w/v 的疊氮化鈉）的溶液中，存放于+4到+8 °C。抑菌劑可以在沖洗步驟時(shí)引入（見囊泡收集后部分）。

使用前

如下圖所示：

• 將柱子固定，使液面水平（確保柱子垂直）

• 不要移除底部滑動(dòng)蓋

• 小心緩慢地移去頂蓋

柱子的平衡

• 移除底部滑動(dòng)蓋，并且使用至少 10 mL 洗脫緩沖液（PBS）沖洗柱子。如果不是使用PBS 洗脫，那么至少使用 30 mL 洗脫緩沖液沖洗柱子。記下 5 ml 緩沖液通過尺寸排阻柱通過的時(shí)間，這可用于判斷何時(shí)需要清洗柱子。

• 確認(rèn)有充分的平衡時(shí)間使柱子溫度介于操作溫度范圍內(nèi)。

• 不要使柱子變干。頂部的篩板必須保持濕潤(rùn)。柱子變干會(huì)影響其功能。

• 使用當(dāng)天新配的過濾（0.2 μm）緩沖液避免引入顆粒物污染。

• 為了的結(jié)果，建議購(gòu)買 Izon Prep and Reagent 試劑盒。

• 如果在操作溫度范圍之外使用，可能會(huì)得到錯(cuò)誤的結(jié)果。

樣品的純化

***.樣品的引入的應(yīng)用

1. 在柱子移除底部滑動(dòng)蓋之前，用移液槍移除篩板頂部的緩沖液。

2. 加入 500 μL 樣品。

3. 立即移去底部滑動(dòng)蓋。

4. 立即開始收集 0.5 mL 餾分；

• *開始的六個(gè)餾分（3.0 mL）是空隙體積，不包含囊泡，通常無(wú)需分析。

• 建議將空隙體積收集在同***個(gè)收集管中來(lái)節(jié)約時(shí)間，并可避免 6 個(gè)單獨(dú)的管子帶來(lái)的測(cè)量誤差。

5. 當(dāng)*后的樣品剛剛進(jìn)入柱子頂部篩板（與之相平），加入更多的緩沖液，但是不要高于頂部篩板 2 mL。

• 等待直到*后***滴樣品剛剛進(jìn)入柱子頂部篩板，避免樣品稀釋。

二. 樣品餾分收集

當(dāng)依據(jù)操作流程使用 qEV 柱時(shí)，EVs 大多數(shù)洗脫于餾分 7、8 和 9 中，去除了～99.8 %的蛋白；

大于 10 的餾分包含更多的蛋白和更少的囊泡，不建議分析。為了得到更高的 EV 回收率，餾分可以合并起來(lái)，但是，合并餾分會(huì)稀釋 EVs 的濃度。

方法 A — 得到的純度和濃度

不同的樣品會(huì)得到不同的洗脫峰形，因此建議預(yù)先測(cè)量 EV 濃度并對(duì)所有餾分（7 - 11）進(jìn)行蛋白純化。

1. 空隙體積之后立即收集 3 個(gè)囊泡餾分，每個(gè)餾分 500 μL（餾分 7、8 和 9）。

2. 測(cè)量每個(gè)餾分的 EV 濃度（使用 Izon qNano）和蛋白純度。

• 為了得到高濃度囊泡，使用 EV 濃度的餾分（通常 7 和 8）。注意：合并餾分會(huì)稀釋 EV 濃度。

• 為了得到高純度囊泡，使用蛋白濃度的餾分。

方法 B — ***般使用操作

空隙體積之后立即收集***個(gè)囊泡餾分，1500μL。為了減少蛋白污染，建議只收集 1000 μL。

三. 囊泡收集后

當(dāng)收集完囊泡餾分之后，用至少 10 mL 緩沖液沖洗柱子，并按照《保存》部分的要求保存柱子。記下 5 ml 緩沖液通過尺寸流過尺寸排阻柱所需要的時(shí)間，這對(duì)于檢測(cè)何時(shí)清洗柱子很有用。流速的改變可能暗示柱子被堵住或被污染。

qEV 柱的維護(hù)

再次使用

如何檢測(cè)柱子何時(shí)被污染并需要清潔；

• 流速相比初始流速開始變緩。因此建議測(cè)量初始沖洗流速（和／或空隙體積）作為對(duì)比。

• 如果較先前相似的樣品來(lái)說回收率明顯下降，那么期望的 EVs 產(chǎn)率也相應(yīng)下降。如果是這樣，使用 Izon CPC100 校正顆粒（稀釋于 PBS 緩沖溶液中），收集餾分并使用qNano 測(cè)量至少 2000 個(gè)數(shù)。兩個(gè)峰值餾分的回收率應(yīng)該>50%。

• 在沖洗完后，柱子頂端有顏色的變化。

注意

• 對(duì)于新的柱子和干凈或再生的柱子，頂蓋和凝膠表面之間的空間說明儲(chǔ)存過程當(dāng)中凝膠有所沉降，并不影響其性能。為了使

樣品的稀釋影響*小化，可以將頂蓋向下推動(dòng)<2 mm。

• 當(dāng)囊泡餾分隨后被用于 PCR 或 RT-PCR 時(shí)，建議柱子單次使用。

柱子的再生

通常使用 20 到 30 mL 緩沖液清洗柱子，隨后使用新緩沖液平衡柱子（如果更換環(huán)境）。在***些應(yīng)用中，變性的蛋白或脂質(zhì)不會(huì)在再生步驟中被洗脫下來(lái)。可以通過下面的清洗步驟來(lái)去除。

柱子的清洗

去除沉淀蛋白、非特異性吸附蛋白和脂蛋白用 10 mL 0.5 M NaOH 清洗柱子，然后用至少 30到 50 mL 緩沖液沖洗柱子，并檢查洗脫溶液pH。

去除強(qiáng)非特異性吸附蛋白、脂蛋白和脂質(zhì)

用 20 mL 非離子型表面活性劑溶液，如 0.1 %Triton X-100 清洗柱子，然后用至少 20 到 30mL 緩沖液沖洗柱子。

在某些情況下，***些樣品仍會(huì)殘留痕量蛋白。在清洗結(jié)束時(shí)再次檢查蛋白含量，如果蛋白水平高于預(yù)期，再清洗***次。

柱子的消毒

消毒可以程度減少凝膠的微生物污染。用10 mL 0.5 M NaOH 清洗柱子。然后用 30 到 50mL 無(wú)菌緩沖液平衡柱子，并檢查洗脫溶液pH。

注意

• 脫氣緩沖液有助于避免凝膠基質(zhì)中氣泡的產(chǎn)生。少量的氣泡（<10）對(duì)柱效影響極小。

• 建議使用 0.15 M 或更高離子強(qiáng)度的緩沖液，以避免溶質(zhì)與凝膠基質(zhì)之間產(chǎn)生不必要的離子相互作用。

• 為了避免尺寸排阻柱的堵塞，建議過濾或低速離心生物樣品以去除大顆粒物。

柱子的性能指標(biāo)

囊泡的峰值洗脫

• 對(duì)于 500 μL 的樣品體積，囊泡的洗脫峰值在 4.0 mL ± 0.5 mL。

• 兩個(gè)峰值餾分的回收率大約 50 %。

• 對(duì)于 500 μL 的樣品，峰值餾分通常在餾分 8 和 9 之中。如果希望更高的純度，可以只收集*早的峰值餾分。

通過測(cè)定 280 nm 處的紫外吸收可以得到 qEV柱的蛋白洗脫圖。通過 Bradford 法可以準(zhǔn)確測(cè)定每個(gè)餾分中蛋白的精確含量。圖 1 展示了當(dāng)500 μL 血漿樣品上樣至柱上時(shí)的囊泡洗脫圖。每個(gè)餾分的囊泡濃度通過 qNano 測(cè)量，蛋白含量通過 280 nm 處的吸收值來(lái)測(cè)量。

囊泡的富集是十分明顯，它們主要存在于餾分7、8 和 9 中。血清蛋白的洗脫更慢***些，主要存在于餾分 11 - 30 中。大于 10 的餾分通常含有高濃度的蛋白和低濃度的囊泡，不建議用來(lái)做分析。

EVs 的洗脫始于餾分 7，餾分 8 和 9 的濃度達(dá)到。收集越多的餾分，EVs 的總回收率越高。

圖 2 血漿中 EVs 的回收率說明了這點(diǎn)。但是，收集的餾分越多，EV 的回收濃度就會(huì)越稀釋。見表 1。

上樣體積

上樣體積越大，囊泡餾分中的囊泡純度越低。圖 3 展示了血清上樣體積為 100 μL，500 μL 和2000 μL 時(shí)的囊泡分布。2000 μL 的樣品導(dǎo)致囊泡程度地被蛋白污染。2000 μL 樣品中外泌體的出峰延遲顯而易見。

為了得到更純的 qEV，建議*佳的樣品體積為100 μL 至 500 μL，這樣囊泡會(huì)洗脫于餾分 7 至9 之中。

圖 4 展示了血清上樣體積為 100 μL 和 500 μL 時(shí)的囊泡洗脫圖。

囊泡的損失發(fā)生在當(dāng)樣品體積大于 500 μL 時(shí)，囊泡的洗脫峰很寬以至于***些囊泡從餾分 11中被洗脫下來(lái)。這些餾分不建議用來(lái)分析因?yàn)?/span>包含了大量的干擾蛋白。

純化

圖 5 展示了餾分 7 到 9 之間含有很少量的蛋白，且越后面的餾分中蛋白含量越多。

圖 6 展示了經(jīng)過 qEV 柱純化后，EVs 相對(duì)于蛋白的純化度。每個(gè)餾分的純化因子（純化前后蛋白的減少比例）如圖所示。餾分 7 和 8 富集的 EVs *多，也就是相對(duì)于回收的囊泡來(lái)說大部分蛋白被除去。

qEV 柱純化過程中的稀釋

為研究 qEV 純化過程中對(duì)樣本的稀釋，用已知濃度的聚苯乙烯納米顆粒標(biāo)準(zhǔn)品和脂質(zhì)體來(lái)模擬 EVs 的尺寸和組成。

稀釋因子取決于哪些餾分被合并起來(lái)。起始體積為 500 μL 的聚苯乙烯納米顆粒標(biāo)準(zhǔn)品（直徑眾數(shù)為 400 nm）的總回收率為～***。

圖 7 說明合并餾分 5 至 11 可以得到 ***的顆粒回收率。這導(dǎo)致稀釋因子為 7，并且收集的餾分含有大量的干擾蛋白，因此不適于實(shí)際應(yīng)用。

表 1 展示了收集不同餾分的稀釋因子以及回收率。

雖然可以獲得 100％的回收率，但是也可以通過測(cè)量每***個(gè)餾分的顆粒濃度，將濃度的兩個(gè)餾分合并起來(lái)。因此回收率與純度之間存在折衷。當(dāng)將餾分 7 和 8 合并起來(lái)時(shí)，脂質(zhì)體實(shí)驗(yàn)的回收率為～50 %，與聚苯乙烯納米顆粒的結(jié)果相***致。

依據(jù) EVs 的*終濃度，可以不稀釋餾分，直接用 qNano 來(lái)測(cè)量每個(gè) 餾 分 的濃度。對(duì)于qNano，每分鐘 500 到 1600 個(gè)顆粒是*佳速率。如果樣品速率高于這個(gè)范圍則需要進(jìn)行稀釋。

如果依據(jù)這個(gè)操作步驟來(lái)使用 qEV 柱，并且每個(gè)餾分的體積很精確的話，EVs 會(huì)始終洗脫于餾分 7、8 和 9，而餾分 10 和 11 中的含量很少。

操作溫度

qEV 柱經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量控制，流速大約 1 毫升/分鐘（±0.2 毫升/分鐘）。對(duì)于***些樣品來(lái)說，操作溫度可能會(huì)影響流速，*終影響 EVs的洗脫峰形。

回收率的優(yōu)化溫度為在 15 °C 和 25 °C 之間 ，因此推薦的操作溫度為 15 - 25 °C 。

大體積樣品的操作 4

對(duì)于***些生物流體來(lái)說， qEV 純化前，可以通過將樣品預(yù)先濃縮來(lái)獲得更多的外泌體。根據(jù)所使用的樣品和其它制備步驟，此操作步驟可以根據(jù)需要相應(yīng)修改。

1）取定量的細(xì)胞培養(yǎng)液，將樣品離心 1500 g，10 分鐘，隨后離心 3000 g，10 分鐘，取上清液。對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞來(lái)說，則需要更高的離心力。

2）用 Merck Millipore 離心裝置或等同的裝置來(lái)濃縮細(xì)胞培養(yǎng)液。Amicon Ultra 15 是***種 50mL Falcon 類型裝置，需要很低的離心轉(zhuǎn)速，*高 4000 g。這樣的話每次離心需要 15 分鐘。這個(gè)裝置可以將 15 mL 液體濃縮至 300-500 μL。

3）如果樣品中含有不溶物，在 qEV 純化前10,000 g 離心 10 分鐘，去除沉淀。否則這些沉淀會(huì)對(duì)后續(xù) TRPS 分析造成影響。

4）樣品經(jīng)過以上濃縮便可以按照上面第二部分來(lái)進(jìn)行 qEV 純化了。樣品餾分收集見第 2 頁(yè)。

qEV 餾分的 TRPS 分析

對(duì)于 TRPS 分析來(lái)說，Izon Science 推薦使用Izon 試劑盒，這個(gè)試劑盒可以用來(lái)預(yù)涂納米孔并可以在整個(gè)操作過程中使用。

在 TRPS 的準(zhǔn)備階段和操作階段中，需要過濾所有試劑以避免污染或者大顆粒對(duì) TRPS 濃度測(cè)試的干擾。Izon Science 推薦使用當(dāng)天新配的過膜（0.22 μm 注射器式濾器）試劑。

用 TRPS 分析 qEV 餾分時(shí)，Izon Science 推薦將餾分在初始電解液稀釋 1/5 或 1/10。優(yōu)化稀釋比例，使得壓力下的通過速率為約每分鐘500-1600 個(gè)顆粒，以避免納米孔堵塞。

如果對(duì)于 TRPS 分析來(lái)說囊泡濃度過低，需要濃縮樣品（見下面）。下面部分介紹 qEV 餾分收集后的樣品濃縮。

qEV 餾分收集后的樣品濃縮

對(duì)于小體積樣品或?qū)τ谏?EVs 的樣品來(lái)說，濃縮囊泡可以使分析變得更簡(jiǎn)單。下面的方法可以在 0.5 - 1 h 之內(nèi)濃縮收集到的囊泡。

通過 Merck Millipore Microcon-30 裝置濃縮小體積樣品（需要實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)達(dá)到 14,000 g 的離心力）。可以將 0.5 mL 樣品濃縮至大約 200μL。可以重復(fù)濃縮獲得更多的樣品（比如餾分7-9）。

術(shù)語(yǔ)表

色譜：***種樣品中成分分離的方法。由固定相和流動(dòng)相組成，樣品的各組分在兩相之間分配。固定相可以是固體，固體支持液體或凝膠。固定相可被填充在柱中，伸展為固定層或分布為薄膜。流動(dòng)相可以是氣體或液體。

柱體積：填充材料和空隙體積的體積和（可簡(jiǎn)稱為床體積）。

餾分：表示從柱上收集的特定體積，對(duì)于給定體積數(shù)值恒定。也就是說，餾分 7 的 0.5 毫升是指收集的 3.0 毫升至3.5 毫升中的 0.5 毫升。

脫氣：指將溶液抽真空來(lái)“煮”掉多余的溶解氣體，如將燒瓶抽真空。

流速：載液的體積流量，單位為 mL / min。

空隙體積：柱中固定相的總體積；柱子的其余部分由凝膠材料填充。它表示了 SEC 的排除體積。

囊泡餾分：囊泡出現(xiàn)在的餾分。

回收率：囊泡從柱子流出的量與進(jìn)入柱子的量的百分比。